研究背景：胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）是一种高度侵袭性、预后极差的恶性脑肿瘤。其中，以替莫唑胺（Temozolomide, TMZ）为基础的化疗方案受到耐药性的严重限制，极大地影响了临床疗效。近年来，RNA表观遗传修饰，特别是N⁶-腺嘌呤甲基化（m⁶A修饰）以及组蛋白翻译后修饰（Post-Translational Modifications, PTMs）在肿瘤发生发展及耐药性形成中的作用引起了广泛关注。然而，m⁶A修饰如何与组蛋白PTMs协同作用，促进GBM对TMZ产生耐药性，其具体分子机制仍未阐明。
方法：本研究采用逐步递增浓度的方法构建TMZ耐药GBM细胞系，并基于该模型开展多组学分析。首先，通过RNA转录组测序（RNA-seq）筛选与TMZ耐药相关的m⁶A调控因子，并利用qRT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光、MTT细胞增殖实验及TMZ IC50测定进行验证。随后，结合m⁶A甲基化测序（MeRIP-seq）、RNA免疫共沉淀测序（RIP-seq）及核糖体测序（Ribo-seq），解析m⁶A调控因子的下游靶点。进一步，整合TCGA、CGGA、GEO及CCLE等公开数据库的GBM表观遗传数据，并采用单样本基因集富集分析（ssGSEA）、加权基因共表达网络分析（WGCNA）及机器学习方法，筛选耐药相关的组蛋白PTMs，并结合ChIP-qPCR、共免疫沉淀（Co-IP）、蛋白质组学分析及单细胞RNA测序（scRNA-seq）探讨其潜在调控机制。此外，利用BALB/c裸鼠GBM原位移植瘤模型，评估关键因子对TMZ治疗敏感性的影响。
结果：本研究成功构建了两株TMZ耐药GBM细胞系（U251-TR和U118-TR），并观察到耐药细胞系中MGMT表达被重新激活。RNA-seq及通路富集分析显示，耐药细胞系中m⁶A及组蛋白PTMs相关通路显著上调。进一步实验表明，m⁶A阅读蛋白YTHDF1在耐药细胞中显著上调，并影响GBM细胞对TMZ的敏感性。此外，即使MGMT启动子处于甲基化状态，YTHDF1的过表达仍可显著上调MGMT的表达。MeRIP-seq及RIP-seq分析显示，MGMT mRNA上不存在m⁶A修饰，且YTHDF1未直接结合MGMT mRNA。多组学分析进一步表明，YTHDF1能够促进组蛋白H3K9乙酰化（H3K9ac）修饰，而m⁶A-qPCR、YTHDF1-RIP-qPCR、Ribo-seq及Co-IP实验则证实YTHDF1可通过m⁶A依赖性机制调控溴结构域蛋白3（BRD3），并且BRD3能够特异性识别并结合H3K9ac修饰。作为关键的组蛋白乙酰化调控因子，BRD3与H3K9ac协同增强转录因子SP1在MGMT启动子区域的结合，从而促进MGMT的转录激活。功能实验显示，敲低BRD3可显著逆转YTHDF1过表达导致的耐药性，并增强TMZ诱导的GBM细胞凋亡。裸鼠原位移植瘤模型进一步证实，YTHDF1敲低可显著抑制肿瘤生长，增强TMZ的治疗效果，并延长小鼠生存期。
结论：本研究从m⁶A修饰与组蛋白翻译后修饰的协同作用角度，揭示了YTHDF1-BRD3-H3K9ac-SP1-MGMT轴在GBM TMZ耐药中的表观遗传调控机制。研究结果不仅加深了对GBM耐药性分子机制的理解，也为靶向m⁶A修饰及组蛋白PTMs提供了新的潜在治疗策略，以克服GBM的TMZ耐药性。

Temozolomide (TMZ) resistance remains a major obstacle in the treatment of glioblastoma (GBM). Here, we demonstrate that the m⁶A reader YTHDF1 plays a pivotal role in mediating TMZ resistance through an epigenetic mechanism involving histone modifications. Using RNA-seq, MeRIP-seq, RIP-seq, and Ribo-seq, we identified that YTHDF1 promotes the translation of BRD3 in an m⁶A-dependent manner. BRD3, in turn, recognizes H3K9 acetylation and cooperates with transcription factor SP1 to upregulate MGMT expression, despite persistent promoter methylation. Functional assays and in vivo models confirmed that disruption of the YTHDF1-BRD3-H3K9ac-SP1 axis sensitizes GBM cells to TMZ and suppresses tumor growth. These findings reveal a novel epitranscriptomic-epigenetic crosstalk underlying TMZ resistance and suggest that targeting this regulatory pathway may enhance therapeutic outcomes in GBM.