【研究目的】 生长激素（growth hormone, GH）和胰岛素样生长激素（insulin growth hormone1, IGF-1）是调控机体生长发育、新陈代谢的重要因子。生长激素缺乏（growth hormone deficiency, GHD）患者由于 GH/IGF-1 水平显著低于正常数值而导致骨代谢 异常，骨折风险升高，骨骼肌质量和力量下降，糖脂代谢紊乱，但是其功能受损的 作用机制仍需进一步深入研究。代谢组学、转录组学、蛋白质组学等多种分子生物 学技术已经被广泛用于研究 GHD 表型改变的作用机制。因此，本研究旨在联合微 型计算机断层扫描技术（Micro-computed tomography, Micro-CT）和代谢组学、转录 组学、蛋白质组学等分子生物学技术，观察孤立性 GH 缺乏的 dw/dw 大鼠的身体测 量指标、血清生化指标、骨代谢指标的变化，分析其骨骼、肝脏、骨骼肌表型改变 及其可能的作用机制，进一步为 GH 对生长和糖脂代谢调节的相关研究提供实验依 据，为未来了解 GHD 患者表型改变的作用机制提供一定的帮助。 【研究方法】 本部分研究共包含以下整体水平、骨骼水平、肝脏水平、骨骼肌水平四个方面 的研究。 （一）在整体水平的研究：在相同环境下饲养 Lewis 品系纯合侏儒大鼠（Lewis dwarf homozygous，dw/dw）大鼠和 Lewis 品系野生型大鼠（Lewis wild type，wt/wt）大鼠。 通过 wt/wt 大鼠与 dw/dw 大鼠交配产生杂合型（Lewis dwarf heterotype，dw/+）大 鼠。本课题共研究两批大鼠：① 29 周 dw/dw（n=24，雄性/雌性：12/12）和 29 周 wt/wt 大鼠（n=16，雄性/雌性：8/8）；② 37 周 dw/dw（n=10，雄性/雌性：5/5）和 37 周 dw/+大鼠（n=10，雄性/雌性：5/5）。测量这两批 wt/wt、dw/+、dw/dw 大鼠的 体重、体长、脏器质量，并计算脏器系数。测量血清生化和骨代谢相关指标。采用 酶联免疫吸附方法（ELISA），测定血清 IGF-1 和 β-胶原特殊序列（β cross-linked C telopeptide of type I collagen, β-CTX，骨吸收指标）的水平。 （二）在骨骼水平的研究：（1）测量两批 wt/wt、dw/+、dw/dw 大鼠的股骨质量和直 径，HE 染色观察股骨组织学特点，利用 Micro-CT 分析其骨微结构的改变。（2）提 取大鼠股骨的总蛋白，采用蛋白质组学技术，寻找 29 周雌性 dw/dw 和 29 周雌性 wt/wt 大鼠股骨的差异蛋白质，利用 KEGG 数据库，对差异蛋白质进行功能注释和 通路分析，寻找与骨微结构改变显著相关的差异蛋白。（3）采用血清非靶向代谢组 学方法，分析 37 周 dw/dw 大鼠和 dw/+大鼠的血清差异代谢物，同样利用 KEGG 数据库对差异代谢物进行功能注释和通路分析，并对主要差异代谢物与骨微结构参 数，进行 Spearman 相关性分析。 （三）在肝脏水平的研究：（1）取固定好的肝脏组织样本，行 HE 染色观察肝脏组 织学特点。（2）采用肝脏非靶向代谢组学方法，分析 37 周 dw/dw 和 dw/+大鼠的肝 脏差异代谢物，利用 KEGG 数据库，对差异代谢物进行功能注释和通路分析，对主 要差异代谢物与肝脏表型指标进行相关性分析。 （四）在骨骼肌水平的研究：本部分由动物实验、细胞实验两部分构成。 动物实验：（1）称量 29 周雄性 wt/wt 大鼠和 29 周雄性 dw/dw 大鼠股四头肌的质量。 采用 HE 染色观察股四头肌的组织学特点，同时测量肌纤维的直径和横截面积。（2） 提取股四头肌的 RNA，采用 RT-qPCR 的方法，观察两组大鼠股四头肌中成肌细胞 增殖、凋亡、分化相关基因 mRNA 的表达水平。（3）采用 RNA seq 方法，筛选两 组大鼠股四头肌中的差异基因，利用 KEGG 数据库，对差异基因进行功能注释和通 路分析，寻找与骨骼肌表型相关的关键差异基因，利用 RT-qPCR 在组织学水平上进 行验证。 细胞实验：（1）体外培养小鼠 C2C12 成肌细胞，给予诱导分化培养基，观察 C2C12 成肌细胞在分化为成熟肌管过程中的形态变化。（2）不同浓度的 IGF-1Ab（模拟 GH 缺乏状态）或 IGF-1 处理 C2C12 成肌细胞，采用 CCK8 方法，观察上述处理对 C2C12 成肌细胞增殖能力的影响。提取细胞总 RNA，采用 RT-qPCR 的方法，观察上述处 理对成肌细胞增殖、凋亡、分化相关基因以及骨骼肌 RNA seq 筛选的关键基因 FOXO1、Hes1 和 PDK1 的 mRNA 表达水平。提取细胞总蛋白，采用 western blot 方 法检测成肌细胞分化相关基因 MyoD 以及骨骼肌组织 RNA seq 筛选的关键基因在 蛋白水平的变化。（3）诱导分化 C2C12 成肌细胞，在分化的 1~4 天给予 IGF-1Ab 处 理，在 5~8 天转为 IGF-1 处理，观察以上相关基因的 mRNA 表达水平在给予 IGF-1 处理后能够挽救。 【研究结果】 （一） 孤立性 GH 缺乏对大鼠身体测量和血清生化指标的影响 （1）与 29 周 wt/wt 大鼠相比，29 周 dw/dw 大鼠（包括雌性和雄性）身材矮小，体 重下降约 36.9%（319.2 ± 50.1g vs 196.2 ± 38.9g）和体长下降约 11.9%（42.9 ± 3.8 cm vs 38.4 ± 3.9cm），血清 IGF-1 降低 45.2%，葡萄糖水平降低 31.0%，骨吸收标志物 β CTX 升高 1.2 倍（P 均<0.05）。（2）与 29 周的结果类似，37 周 dw/dw 大鼠（包括雌 性和雄性）体重、体长、血清和肝脏 IGF-1 水平均显著低于 37 周 dw/+大鼠，但是 ALT 和 AST 分别升高约 66.7%和 41.5%（P<0.05）。 （二）孤立性 GH 缺乏对大鼠骨骼的影响 （1）与 29 周雄性 wt/wt 大鼠相比，29 周雄性 dw/dw 大鼠股骨质量、长度和直径分 别减少 44.5%、31.7%和 14.9%（P<0.05）。股骨 HE 染色结果显示，dw/dw 大鼠骨小 梁数目减少，骨小梁排列不规则。Micro-CT 显示骨小梁骨密度（Tb.vBMD）和骨皮 质骨密度（Ct.vBMD）分别降低 31.6%和 24.6%（P<0.05），表明 29 周雄性 dw/dw 大鼠骨骼微结构明显受损。与雄性的结果类似，29 周雌性 dw/dw 大鼠的 Tb.vBMD 和 Ct.vBMD 分别降低 38.7%和 19.4%（P<0.05），表明骨骼微结构恶化。（2）进一 步对 29 周雌性 wt/wt 大鼠和 29 周雌性 dw/dw 大鼠的股骨进行蛋白质组学分析，筛 选得到 656 个差异蛋白质，其中上调蛋白 45 个，下调蛋白 611 个。KEGG 通路主 要富集在胞内小泡介导途径、血小板脱粒等通路。其中，A2m、Pf4、Lgmn、Camk2d 四种显著差异的蛋白质与骨骼微结构改变相关。（3）与 29 周大鼠的结果类似，MicroCT 结果显示 37 周 dw/dw 大鼠 Tb.vBMD 下降 15.9%，骨体积/总体积（BV/TV）下 降 22.8%，提示骨微结构也显著差于 37 周 dw/+大鼠。（4）37 周 dw/dw 大鼠和 dw/+ 大鼠血清非靶向代谢组学结果表明，共筛选出 134 个（阳离子模式）和 49 个（阴离 子模式）差异代谢物。dw/dw 大鼠 LPC20:3，LPC22:6，LPC22:4，皮质醇和组胺五 种代谢物水平明显升高，并且与骨微结构参数显著相关（P<0.05）。 （三） 孤立性 GH 缺乏对大鼠肝脏的影响 （1）与 29 周 wt/wt 大鼠相比，29 周 dw/dw 大鼠（包括雌性和雄性）肝脏质量降低 36.0%（P<0.05），肝脏系数无显著差异，肝细胞排列整齐，结构正常。（2）与 37 周 的 dw/+大鼠相比，37 周 dw/dw 大鼠肝脏质量也下降 35.2%（P<0.05）。然而肝脏 HE 染色结果显示，37 周 dw/dw 大鼠肝脏脂滴数目增多，脂肪变性程度显著，炎症细胞 浸润增多。（3）37 周 dw/dw 大鼠和 dw/+大鼠肝脏非靶向代谢组学分析，共筛选出 88 个（阳离子模式）和 51 个（阴离子模式）差异代谢物。KEGG 通路主要富集在 精氨酸和脯氨酸代谢、胆汁分泌等代谢通路。dw/dw 大鼠中 LPC 16:2，LPC 18:3， LPC 22:6 和 FAHFA 18:1 等差异代谢物和肝脏的异常表型显著相关（P<0.05）。 （四） 孤立性 GH 缺乏对大鼠骨骼肌的影响 动物实验：（1）与 29 周雄性 wt/wt 大鼠相比，29 周雄性 dw/dw 大鼠的股四头肌质 量和直径分别下降 28.5%和 22.0%（P<0.05）。HE 染色结果显示，骨骼肌排列紊乱， 肌间隙增宽，炎症细胞浸润增多。进一步研究发现，29 周雄性 dw/dw 大鼠股四头肌 中成肌细胞增殖相关基因 Cyclin D、 Cyclin E 和 Cyclin B 表达水平降低，细胞增殖 负调控因子 p21 和促凋亡相关基因 Bax 表达升高，成肌细胞分化相关基因 MyoD、 MyHC、Myogenin 表达降低（P<0.05），提示 dw/dw 大鼠成肌细胞增殖和分化明显 受损。（2）29 周雄性 wt/wt 大鼠和 dw/dw 大鼠的骨骼肌 RNAseq 分析发现，两组之 间共存在 765 个差异表达基因。KEGG 通路主要富集在 PI3K/PDK1/Akt、MAPK/ERK、 Notch 等信号通路。其中，dw/dw 大鼠 PDK1 的 FPKM 数值（基因在样本中的表达 量）降低 67.6%，FOXO1 和 Hes1 表达量分别升高 1.1 倍和 80.5%（P<0.05），RTqPCR 进一步验证了这些变化。以上结果提示， dw/dw 大鼠骨骼肌表型受损，成肌 增殖和分化受到抑制，PDK1、FOXO1、Hes1 在这一过程中发挥重要的作用。 细胞实验：（1）C2C12 成肌细胞在诱导分化过程中，梭形细胞变成纤维状，肌细胞 逐渐融合成肌管，在第 8 天诱导分化成熟。（2）用不同浓度的 IGF-1Ab 处理 C2C12 成肌细胞，发现 IGF-1Ab 能抑制成肌细胞增殖，Cyclin D、Cyclin E 和 Cyclin B 的 mRNA 表达水平降低、p21 和 Bax 表达升高，MyoD、MyHC、Myogenin 表达降低 （P<0.05），且高浓度组（10nmol IGF-1 Ab）效应最明显，表明 IGF-1 缺乏能够抑制 成肌细胞增殖和分化。（3）此外，IGF-1Ab 处理 C2C12 细胞还能下调 PDK1 表达， 上调 FOXO1 和 Hes1 表达，其中高浓度组（10nmol IGF-1 Ab）PDK1 的 mRNA 表 达水平降低 75.8%，FOXO1 和 Hes1 分别升高了 9.7 倍和 3.4 倍。Western blot 的结 果也表现出一致的变化趋势，FOXO1 蛋白水平显著增加了 1.1 倍，PDK1 蛋白水平 显著降低 71.1%（P 均<0.05），Hes1 蛋白水平有升高趋势。（4）而用不同浓度的 IGF1 处理 C2C12 细胞，以上成肌细胞增殖、分化相关基因以及 PDK1、FOXO1、Hes1 基因的 mRNA 水平和蛋白水平均得到逆转。其中高浓度（100ng/ml IGF-1 组）PDK1 的 mRNA 表达水平升高约 12.8 倍，FOXO1 和 Hes1 降低约 87.3%和 96.6%（P 均 <0.05）。Western blot 的结果也发现 FOXO1 的蛋白水平降低 75.4%，PDK1 蛋白水 平升高 1.6 倍（P<0.05）, Hes1 的蛋白水平有降低趋势。（5）在诱导分化 C2C12 细 胞第 5 天~第 8 天给予 IGF-1 处理，能够逆转从第 1 天~第 4 天 IGF-1Ab 对成肌细胞 分化的影响（P 均<0.05）。值得注意的是，与只接受 IGF-1Ab 处理组相比，在第 5 至第 8 天接受 IGF-1 处理组 PDK1 的 mRNA 表达水平升高 1.9 倍，FOXO1 和 Hes1 的 mRNA 表达水平下降 79.3%和 46.5%（P 均<0.05），提示 IGF-1Ab 对 PDK1、 FOXO1 和 Hes1 的作用也可以被 IGF-1 逆转。 【研究结论】 1. 孤立性 GH 缺乏的 dw/dw 大鼠体型矮小，血清 IGF-1 水平明显降低。 2. 孤立性 GH 缺乏的 dw/dw 大鼠骨骼微结构受损，与 A2m、Pf4、Lgmn、Camk2d 四种差异蛋白质和 LPC20:3、LPC22:6、LPC22:4、皮质醇和组胺五种血清代谢物 显著相关。 3. 孤立性 GH 缺乏的 dw/dw 大鼠肝脏功能受损，与 LPC 16:2、LPC 18:3、LPC 22:6 和 FAHFA 18:1 等代谢物显著相关。 4. 孤立性 GH 缺乏的 dw/dw 大鼠骨骼肌质量下降，肌纤维直径减少，成肌细胞增 殖能力降低，分化能力受抑制。该作用可能是通过上调 FOXO1 和 Hes1 的表达， 和下调 PDK1 的表达来实现的。 第二部分 孤立性 GH 缺乏的 dw/dw 大鼠的遗传学探究 【研究目的】 孤立性生长激素缺乏症（Isolated growth hormone deficiency, IGHD）是常见的垂 体激素缺乏症，约 3%至 30%的病例具有家族遗传的特点。编码生长激素释放激素 受体（growth hormone releasing hormone，GHRHR）基因是最常见的突变基因之一。 研究报道至少存在 20 种 GHRHR 基因突变能够影响 GH 水平。Lewis 品系纯合侏儒 （dw/dw）大鼠是一种经典的孤立性 GH 缺乏的动物模型，但是其侏儒表型的遗传 学原因尚不明确。因此，本研究旨在通过观察孤立性 GH 缺乏的 dw/dw 大鼠的侏儒 表型，通过靶向 GHRHR 基因以及全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS） 探讨其侏儒的遗传学原因。 【研究方法】 本部分研究包含动物实验和细胞实验两部分 （一）动物实验：（1）Wt/wt 大鼠与 dw/dw 大鼠交配产生杂合型（dwarf heterotype， dw/+）大鼠。记录 wt/wt、dw/+、dw/dw 大鼠从第 5~12 周的体重，处死大鼠，取大 鼠全血、垂体、肝脏等脏器，并绘制生长曲线，计算体重增加量、体重增加百分比、 脏器质量、脏器系数等。提取大鼠垂体和肝脏的总 RNA，采用 RT-qPCR 方法，观 察大鼠垂体 GHRHR、GH 以及肝脏 IGF-1 的 mRNA 表达水平。采用 ELISA 方法测 定血清 IGF-1 水平。（2）提取 wt/wt、dw/+、dw/dw 大鼠全血 DNA，PCR 扩增 GHRHR 基因的全部12个外显子以及转录起始位点上游2022bp的启动子序列，并进行Sanger 测序和序列比对，尝试寻找 dw/dw 大鼠发生基因突变的位点，探究孤立性 GH 缺乏 的 dw/dw 大鼠的遗传学原因。提取以下组织器官的 DNA，包括中枢系统（下丘脑、 垂体）、内分泌系统（甲状腺、肾上腺）、呼吸系统（肺）、循环系统（心脏）、消化 系统（肝脏、胃）、泌尿系统（肾脏）以及运动系统（软骨），同样进行 PCR 扩增和 Sanger 测序，验证上述发现的突变位点。（3）另外，获取其他品系的大鼠，包括 SD （Sprague-Dawley ）和 GK（Goto-Kakizaki）大鼠，提取其肝脏的 DNA，观察这些 大鼠是否存在同样的突变位点。（4）统计 dw/dw 与 dw/+交配产生后代的基因型比 例和性别比例，探究后代 dw/dw 大鼠的遗传家系特征。（5）提取 dw/dw 鼠尾 DNA， 进行 WGS 分析，进一步寻找和分析突变位点。 （二）细胞实验：（1）野生型质粒的构建：从 NCBI 基因库（https://www. ncbi. nlm.nih.gov/nuccore /NM_001398554.1）获得大鼠 rGHRHR 基因启动子从 -2000 到 +22 bp（+1 表示转录起始位点）的目标序列，化学合成 2022bp 目标序列后插 入过渡载体 pUC57 中。合成引物，利用 PCR 扩增获取目标序列。然后将目标序列 构建入经 NheI 和 XhoI 线性化的 pGL-4.10 载体片段，从而构建 pGL4.10-GHRHR P romotor-WT-Luc。pRL-CMV 为内参质粒。（2）突变型质粒的构建：采用 PCR 扩增 含有-667（G＞A）和 -77（G＞A）双点突变的 GHRHR 基因启动子（-2000～+22 bp）的目标序列。利用无缝克隆将扩增的含有双点突变的目标序列构建入经 NheI 和 XhoI 线性化的 pGL-4.10 载体片段，从而构建 pGL4.10-GHRHR Promotor- MUT-Lu c 荧光素酶表达质粒，（3）体外培养 GH3 细胞，采用脂质体转染的方法，将构建好 的 pGL4.10-GHRHR-Promotor-WT-Luc 质粒、pGL4.10-GHRHR-Promotor-Mutant-Lu c 质粒和 pGL4.10-Basic-Luc 对照质粒瞬时转染至 GH3 细胞中，通过双荧光素酶报 告基因的方法观察突变位点对 GHRHR 基因启动子活性的影响。 【研究结果】 （一）动物实验：（1）从第 5 周至第 12 周，雄性 dw/dw 大鼠体重、体重增加量、 体重增加百分比均显著低于雄性 wt/wt 大鼠（P＜0.05），在雌性大鼠也表现出类似 的变化趋势。（2）与 wt/wt 大鼠相比，dw/dw 大鼠垂体 GHRHR、GH 的表达水平以 及肝脏和血清 IGF-1 的水平均显著低于 wt/wt 大鼠（P＜0.05）。（3）dw/dw 大鼠全血 中的 GHRHR 基因在 12 个外显子区域未发现突变，但是在 GHRHR 基因启动子区域 c.-667（G＞A）和 c.-77（G＞A）两个位点发现纯合突变。在下丘脑、垂体、甲状 腺、肾上腺、肺、心脏、肝脏、胃、肾脏、软骨、鼠尾等组织中均能够找到这两个 位点的纯合突变。（3）在 SD 和 GK 大鼠中均未发现上述两个位点的纯合突变。（4） dw/dw 与 dw/+大鼠的交配的后代中，基因型比例和性别比例接近于 1:1，提示在 dw/dw 大鼠中观察到的遗传模式可能为常染色体隐性遗传。（5）WGS 结果显示，与 大鼠 GCF_000001895.5_Rnor_6.0 参考基因组序列相比，dw/dw 大鼠在位于 GHRHR 基因的 5’-UTR 区 85588011 和 85588612 这两个位点发生 G>A 杂合突变。在 3’- UTR 区 85601648 发生 C>G 杂合突变，在 85601850 发生 C>T 杂合突变，并且 3’- UTR 的突变不在结合 3’-UTR 的 miRNA 中。 （二）细胞实验：与 pGL4.10-Basic-Luc 对照质粒相比，转染了 pGL4.10-GHRHR-P romotor-WT-Luc（WT）质粒和 pGL4.10-GHRHR-Promotor-Mutant-Luc（MUT）质粒 的 GH3 细胞中荧光素酶活性分别是对照组质粒的约 1.1 倍和 1.0 倍（P>0.05）。此 外，MUT 质粒的相对荧光素酶活性约为 WT 质粒的 92.9%，表明 WT 和 MUT 质粒之间无显著差异。因此，GHRHR 基因启动子区域 c.-667（G＞A）和 c.-77（G ＞A）两个位点的纯合突变对 GHRHR 基因的启动子活性没有明显影响。 【研究结论】 1. dw/dw 大鼠生长缓慢、体重和体长均减少，垂体 GHRHR、GH 的表达水平以及 肝脏和血清 IGF-1 的水平均显著低于 wt/wt 大鼠。 2. 全血和组织 DNA 的 Sanger 测序结果表明，dw/dw 大鼠在 GHRHR 基因启动子区 域 c.-667（G＞A）和 c.-77（G＞A）两个位点存在纯合突变。质粒转染实验发现， 上述两个位点的纯合突变不影响基因启动子活性，可能不是导致 GHRHR 表达 水平降低的直接原因。 3. WGS 结果显示，dw/dw 大鼠在 GHRHR 基因启动子区域的 5’-UTR 区 85588011 和 85588612 这两个位点发生 G>A 的杂合突变。另外，dw/dw 大鼠在 GHRHR 基 因3’-UTR区也存在突变，并且这些突变不在结合GHRHR基因3’-UTR的miRNA 中。