目的：多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一种具有广泛基因异质性的疾病，其发生机制除了要经历免疫球蛋白重链基因重排以外，还要经历体细胞高频突变，其中主要突变包括KRAS、NRAS、BRAF等基因突变，这些突变可能与MM克隆演变、细胞耐药与预后密切相关。本研究目的主要包括：

探究KRAS、NRAS、BRAF基因突变在MM患者中的表达情况及这些基因突变是否与MM不良预后相关。

探究数字微滴PCR （droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）方法检测上述基因突变的可行性，以及采用该手段检测外周血循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）基因突变与骨髓样本检出率的一致性。

探究泛Raf抑制剂LY3009120抗MM细胞增殖的作用机制。

方法：

ddPCR方法检测MM患者KRAS、NRAS、BRAF基因突变情况：

2010年至2016年收治的85例初诊MM患者为研究对象，与患者签署知情同意书后，提取骨髓单个核细胞、骨髓浆、外周血ctDNA，采用ddPCR的方法检测BRAF V600E，BRAF Mx，KRAS G12/G13, NRAS G12/G13 和NRAS Q61的突变情况，并比较3种样本的突变检出一致率，对该组MM患者生存进行统计学分析，探究这些基因突变对其预后的影响。

MTT法检测LY3009120对MM细胞增殖活性的影响：

3种MM细胞株LP-1、U266、RPMI8226为研究对象，用不同浓度梯度的泛Raf抑制剂LY3009120孵育MM细胞24 h、48h、72h后，采用MTT比色法检测细胞增殖活力的变化。

流式细胞术检测细胞周期变化及细胞凋亡情况：

3种MM细胞株LP-1、U266、RPMI8226为研究对象，以不同浓度LY3009120处理后，采用PI染色法检测细胞周期是否有变化、细胞是否出现凋亡。

Western Blot法检测MM细胞RAF、MEK、ERK蛋白的表达情况：

3种MM细胞株LP-1（RAS基因野生型）、U266（BRAF基因突变）、RPMI8226（KRAS基因突变）为研究对象，采用Western Blot的方法检测RAF、MEK、ERK蛋白的表达水平。

Western Blot法检测细胞信号通路：

3种MM细胞株LP-1、U266、RPMI8226为研究对象，以LY3009120处理后，采用Western Blot方法检测其是否通过PI3K/Akt信号通路发挥生长抑制作用。

实验中所有数据均使用SPSS statistics 21.0统计软件进行统计学分析，生存分析采Kaplan-Meier法，P<0.05为差异具有统计学差异。实验结果相关作图采用GraphPad Prism 5进行图形分析。

结果：

85例MM患者进行了骨髓单个核ddPCR检测：共30人检测出基因突变，检出率为35.3%，其中BRAF Mx突变4例（5%），该4例患者均证实为V600E突变；KRAS Mx突变15例（18%），NRAS G12/G13突变3例（4%），NRAS Q61突变15例（18%）。20例患者同时收集了外周血ctDNA并进行ddPCR检测：其中BRAF Mx突变7例（35%），这7例患者中有3例证实是V600E突变；KRAS Mx突变2例（10%），NRAS G12/G13突变0例，NRAS Q61突变4例（20%）。13例患者骨髓液离心后收取骨髓浆，提取ctDNA后行ddPCR检测：其中BRAF Mx突变1例（8%），该例患者证实是V600E突变；KRAS Mx突变0例，NRAS G12/G13突变0例，NRAS Q61突变1例（8%）。骨髓单个核、骨髓浆、血浆基因突变检出一致率在70%以上。

多数患者突变为亚克隆，共59例患者可纳入生存分析，有上述任一基因突变者总生存（overall survival，OS）明显短于无突变患者，但未达统计学差异（25个月Vs 61个月，P=0.767），同时存在2个以上突变的患者OS并无明显缩短。其中有NRAS（包括G12/G13和Q61）突变的患者OS显著短于无NRAS突变的患者，但未达统计学差异（19个月Vs 61个月，P=0.0526）；KRAS Mx突变患者OS短于无KRAS Mx突变者，但未达统计学差异（19个月 Vs 59个月，P=0.7933）；BRAF突变（包括BRAF Mx和V600E）患者OS与无突变患者亦无统计学差异（59个月Vs 61个月，P=0.8）。

能够统计等位基因突变频率（variant allelic frequency，VAF）的患者一共46例，其VAF中位值为1.4%（范围0.13%-34%），高VAF突变率患者OS短于低VAF突变率患者，但未达统计学差异（24个月 Vs 56个月，P=0.38）。

MTT实验结果得出：LY3009120对3种MM细胞株LP-1、U266、RPMI8226 均具有生长抑制作用，并且随着药物浓度的增加，抑制作用逐渐增强(P < 0.05)，随着药物作用时间的增加，抑制作用亦逐渐增强（P<0.05）。三种细胞株IC50分别为1.5uM、0.2uM、5uM。

流式细胞术测细胞周期实验得出：与对照组相比，LY3009120组在G1期细胞比例增高，提示肿瘤细胞被阻滞在G1期。

流式细胞术测细胞凋亡实验得出：以1uM、10uM、20uM浓度的LY3009120处理3种细胞株后，24h、48h、72h均可观察到细胞凋亡，且随着药物浓度的增加及药物作用时间的延长，凋亡现象逐渐增强（P<0.05）。

Western Blot实验得出：MM细胞株中普遍中等到高强度表达RAF 、p-MEK1,2/ERK1,2蛋白，RAS野生型与突变型细胞株之间的表达无差异。

Western Blot实验得出：用LY3009120处理MM细胞系后，细胞周期调控蛋白P21表达水平上调，凋亡相关蛋白SMAC表达上调，RAF、p-MEK1,2/ERK1,2表达水平下调，P-Akt表达水平下调。

结论：

采用ddPCR技术检测MM患者基因突变敏感性高，可行性强；有RAF、RAS基因突变的患者其OS要短于无突变患者，高VAF患者OS亦短于低VAF患者；ddPCR检测患者外周血ctDNA与骨髓单个核一致率较高，提示采用外周血检测患者基因突变的方法在临床上可行，或可作为MM患者临床预后评价的新指标。

MM细胞株普遍高表达RAF、MEK1,2/ERK1,2蛋白，泛Raf抑制剂LY3009120对MM细胞株具有明显的杀伤作用，主要表现在生长抑制作用和促凋亡作用增强，其可能通过PI3K/Akt信号通路发挥作用，且该药对MM的杀伤作用与RAS、RAF基因突变无关，或可为有RAS、RAF基因突变的MM患者提供一个新的治疗思路。

Background: Oncogenic mutations in BRAF, KRAS and NRAS genes have been reported in multiple myeloma and can be explored as biomarkers for selection of targeted therapies.

Methods: Unamplified DNA from CD138+ bone marrow mononuclear cells and circulating tumor DNA (ctDNA) from serum and bone marrow aspirates from patients with multiple myeloma(MM) was tested for BRAF V600E, KRAS G12/G13, NRAS G12/G13 and NRAS Q61 mutations using multiplex assays for droplet digital PCR (BioRad). Agreement among methods was evaluated and results we compared to clinical outcomes. MM cell lines were treated with pan-Raf inhibitor LY3009120 to detect whether the proliferation of MM cells will be suppressed.

Results: Of 85 patients with multiple myeloma, 4 (5%) were found to have BRAF V600 mutation (all confirmed V600E), 15 (18%) KRAS G12/G13 mutation, 3 (4%) NRAS G12/G13 mutation and 15 (18%) NRAS Q61 mutation in archival tumor tissue. Most mutations were subclonal with a median variant allelic frequency (VAF) 1.4% (range, 0.13%-34%). Survival data were available for 47 patients and patients with high mutation VAF had a trend to shorter survival than patients with low mutation VAF (24 months vs. 56 months, P=0.38). Of these 85 patients 20 (23.5%) had simultaneous serum ctDNA collection, which demonstrated BRAF V600 mutation in 7 (35%; 3 confirmed as V600E), KRAS G12/G13 mutation in 2 (10%), NRAS G12/G13 mutation in 0 (0%) and NRAS Q61 mutation in 4 (20%) of patients. In addition, 13 (15%) patients had simultaneous bone marrow serum aspirate ctDNA collection, which demonstrated BRAF V600 mutation in 1 (8%; confirmed as V600E), KRAS G12/G13 mutation in 0 (0%), NRAS G12/G13 mutation in 0 (0%) and NRAS Q61 mutation in 1 (8%) of patients. Agreement rates for all the 3 samples were more than 70%.Frequent overexpression of Raf isofroms and downstream activation of p-MEK1,2/p-ERK1,2 were found in MM cell lines. The anti-MM effect of pan-Raf inhibitor did not correlated with RAS 

mutation status, and pan-Raf activated both RAS/RAF/MEK/ERK and PI3K/Akt signal pathways.

Conclusion: Common oncogenic mutations in BRAF, KRAS and NRAS genes are prevalent with relatively low VAF in multiple myeloma and can be detected with a sensitive techniques such as ddPCR. Their prognostic significance and therapeutic utility needs to be further investigated. Pan-Raf inhibitor might be a novel reasonable treatment approach for MM patients with or without RAS/RAF mutation.