研究背景

胶质瘤作为成人颅内最常见的恶性肿瘤，术后极易复发，同时预后极差，目前研究广泛认为胶质瘤干细胞（Glioma stem cells，GSCs）以及由于上皮间质转化（Epithelial mesenchymal transition，EMT）所导致的的侵袭性生长特征是导致胶质瘤术后复发的重要原因，然而胶质瘤干细胞和胶质瘤侵袭性的关系及其在肿瘤复发中的调控机制目前仍不清楚。近年来研究表明富亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5（leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5, LGR5）是胃癌及结肠癌中的肿瘤干细胞标记物，然而LGR5是否可作为与EMT相关的胶质瘤干细胞标记物以及是否能够成为胶质瘤治疗的选择靶点需要进一步研究证实。

目的

探讨LGR5是否可以作为GSC标记物及其调控GSCs侵袭性和EMT的机制，进一步探讨LGR5对于预测胶质瘤生存期和复发时间的作用，为恶性胶质瘤的治疗提供新的靶点。

方法

1、对胶质瘤细胞系U87，U251，A172及原代胶质瘤细胞8591，LHH和7112的亲本细胞以及用无血清培养法对以上细胞进行富集培养后得到的富集细胞分别进行LGR5流式细胞检测，并分析其富集倍数；通过免疫荧光对以上细胞进行LGR5及胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein，GFAP）定位检测；

2、对U251和8591胶质瘤细胞进行LGR5流式细胞分选得到LGR5⁺ 和LGR5^- 细胞，分别进行细胞增殖实验、耐药实验、成球实验、侵袭和迁移实验以及体内成瘤实验等干细胞实验。

3、在以上LGR5⁺ 和LGR5^- 细胞中，将LGR5与其他肿瘤干细胞（Cancer stem cells，CSCs）标记物CD133，CD24，CD44，CD90及EpCAM分别以流式细胞法检测两组间各CSC标记物的表达水平。

4、对以上U251和8591富集得到的干细胞分别进行LGR5敲降和过表达，通过Western blot检测以上CSC标记物和干性基因SOX2、Nanog和OCT4的表达水平，免疫荧光法鉴定LGR5和SOX2在GSCs中的表达和定位。

5、对LGR5敲降组（shLGR5）、过表达组（Lenti-LGR5）及Wnt-C59治疗组的GSCs进行侵袭和迁移实验，通过Western blot检测各组中Wnt/β‑catenin信号通路及EMT标记物的表达水平及变化。

6、对shLGR5组、Wnt-C59治疗组和对照组（shCtrl）进行颅内原位移植瘤实验，小动物核磁检测颅内肿瘤生长速度并比较各组生存期差异。

7、免疫组化法在胶质瘤标本中检测LGR5、N-cadherin及Ki67的表达并分析在各级别胶质瘤中的表达水平和关系，免疫荧光检测胶质瘤瘤体和瘤周LGR5的表达水平。

8、Kaplan-Meier法比较低级别和高级别胶质瘤中LGR5高表达和低表达患者的总生存期（Overall survival，OS）和无进展生存期（Progression-free survival，PFS）。COX生存回归对低级别和高级别胶质瘤患者进行单因素和多因素生存分析。

9、以上研究用到的统计方法包括方差检验、Student t检验、Spearman相关分析、卡方检验和费舍尔精确检验。生存分析统计方法包括 Kaplan-Meier 、Log-rank test 和 Cox 比例风险回归模型。

结果

1、流式细胞检测显示免疫荧光鉴定显示胶质瘤细胞系U251，U87，A172及原代胶质瘤细胞8591，LHH和7112的亲本细胞中LGR5阳性细胞比例分别为2.46%，2.01%，5.76%，1.34%，1.79% 和1.45%；而富集得到的干细胞中LGR5阳性比例分别为21.50%，11.23%，16.04%，15.42%，11.41% 和4.53%，其LGR5的富集程度分别提高了8.7、5.6、2.8、11.5、6.4和3.1倍；以上胶质瘤细胞均能够表达GFAP，而LGR5表达水平不尽相同。

2、与LGR5^- 细胞相比，LGR5⁺ 细胞具有更强的体外增殖、耐药、侵袭、迁移、成球能力和体内致瘤性；免疫组化结果表明LGR5在体内肿瘤中与N-cadherin和Ki67具有显著相关性。

3、流式检测表明LGR5⁺ 细胞中CSC标记物CD133、CD44、CD24 和EpCAM表达升高，CD90无变化。同时在shLGR5的GSCs中CD133、CD44、CD24 和EpCAM以及干性基因SOX2，Nanog表达水平下降，OCT4表达水平不变。免疫荧光表明富集得到的GSCs同时表达LGR5和SOX2。

4、shLGR5组GSCs侵袭和迁移能力降低，Lenti-LGR5组GSCs侵袭和迁移能力增加，同时Western blot 表明Wnt/β-catenin信号通路和EMT标志物的表达水平随着LGR5表达减少而降低，LGR5表达增加而升高；Wnt-C59治疗实验表明Wnt/β-catenin信号通路和EMT相关的细胞侵袭和迁移能力均以剂量依赖的形式被Wnt/β-catenin抑制剂Wnt-C59所抑制。

5、颅内肿瘤生长曲线显示与对照组相比，shLGR5组和Wnt-C59组的肿瘤生长显著受到抑制；Log-rank test表明shLGR5组和Wnt-C59组的总生存期明显延长；同时颅内肿瘤免疫组化显示Ki67和Active-β-catenin的表达水平在shLGR5组和Wnt-C59组中显著减少，但二者之间无统计学差异；Spearman 相关分析表明LGR5在颅内肿瘤的表达水平在shLGR5和shCtrl组中与Ki67和Active-β-catenin呈正相关。

6、免疫组化结果表明LGR5、Ki67 和N-cadherin的表达水平均与胶质瘤等级呈正相关，同时Spearman 相关分析 证明LGR5在人胶质瘤标本中的表达水平与Ki67 和N-cadherin相关。此外LGR5与N-cadherin共表达多见于胶质瘤侵袭度高的肿瘤外侧组织中。

7、Log-rank test表明在高级别胶质瘤中，LGR5高表达组（LGR5^high）PFS和OS更短，其中位PFS和OS分别为7.0个月和17.5个月，LGR5低表达组（LGR5^low）中位PFS和OS分别为10.5个月和23.0个月；在低级别胶质瘤中，LGR5^high 组的PFS更短，而OS无统计学差异，LGR5^high 组中位PFS为23.5个月。

8、单因素生存分析表明在高级别胶质瘤中，LGR5、瘤周水肿和同步放化疗和是PFS风险因素，LGR5、Karnofsky评分（KPS）、IDH1突变和同步放化疗是OS风险因素；多因素分析表明，LGR5和同步放化疗是独立的PFS预后因素，而LGR5、IDH1突变和同步放化疗是独立的OS预后因素。在低级别胶质瘤中，单因素分析表明IDH1突变和同步放化疗均是PFS和OS风险因素，而LGR5只是PFS风险因素；多因素分析表明LGR5是独立的PFS预后因素。P < 0.05为具有统计学意义。

结论

1、LGR5可作为一个新的功能性GSCs标记物，能够影响多种肿瘤干细胞标记物和干性基因的表达。

2、LGR5在胶质瘤干细胞中通过上调Wnt/β-catenin信号通路促进EMT相关的细胞侵袭和迁移能力；

3、LGR5是胶质瘤患者生存期的独立预后因素，未来可能成为一个重要的GSCs治疗靶点。

Background: Tumor recurrence, the chief reason for poor prognosis of glioma, is largely attributed to glioma stem cells (GSCs) and epithelial-mesenchymal transition (EMT). However, the mechanisms among them remain unknown. Here, we determined whether leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5 (LGR5), known as a stem cell marker for colon cancer and gastric cancer, can serve as a novel GSC marker involved in EMT and a therapeutic target in glioma.

Methods: Stemness properties were examined in FACS-isolated LGR5⁺/LGR5^- cells. Reported stem cell markers, EMT and the Wnt/β-catenin pathway were examined in stable LGR5 knockdown or overexpressed GSCs by Western Blot. The treatment experiment was performed in an intracranial orthotopic xenograft model by knockdown of LGR5 or by using the Wnt/β‑catenin pathway inhibitor Wnt-C59. LGR5 expression was determined in 268 glioma specimens by immunohistochemistry.

Results: LGR5⁺ cells possessed stronger stemness properties compared to LGR5^- cells. The expression of SOX2, Nanog, CD133, CD44, CD24 and EpCAM was modulated by LGR5. Both LGR5 knockdown and Wnt-C59 reduced tumor invasion and migration and blocked EMT by suppressing the Wnt/β‑catenin pathway in vitro and suppressed the intracranial orthotopic xenograft and prolonged the survival of xenograft mice in vivo. Moreover, LGR5 was positively correlated with Ki67, N-cadherin and WHO grade and negatively correlated with IDH1. Glioma patients with high expression of LGR5 showed significantly poorer prognosis.

Conclusions: LGR5 is a new functional GSC marker and prognostic indicator that can promote EMT by activating the Wnt/β‑catenin pathway and would thus be a novel therapeutic target for glioma.