细胞基质是疫苗生产和检定所使用的主要载体，包括所有来自于动物或人源 的原代细胞、二倍体细胞和连续传代细胞系。生物所目前生产用细胞基质为①二 倍体细胞 KMB17②连续传代细胞系（Vero 细胞）。细胞基质的安全性与终产品 的安全性密切相关。当这些细胞基质用于生产和检定时，需要通过细胞鉴别、外 源因子检测在内的全面检定。 生物所采用的细胞鉴别方法为细胞核型检查法。此方法能够鉴别人源细胞， 但不能够分辨出形态相同的人二倍体细胞 KMB17 或 MRC-5。STR 位点的高度 多态性使得不同个体具有特异性的 STR 图谱,其已广泛应用于亲子鉴定。 STR-PCR 法操作简单、特异性强、灵敏度高，是进行细胞鉴别和有无交叉污染 的最简便有效的方法之一。 本研究针对原来检定生物所细胞基质的方法不足，建立用 STR 位点进行细 胞鉴别的方法。用 STR-PCR方法对 KMB17 细胞进行细胞鉴定时，选取了 19S433、D5S818、D21S11、D18S51、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、 D16S539、CSF1PO、PentaD、vWA、D8S1179、TPOX、PentaE、TH01、D12S391、 D2S1338 和 FGA 共 19 个常染色体位点和 AMEL 性染色体位点，进行了两次重 复 DNA 分型测定。得到的 STR 图谱均完全相同，与中国食品药品检定研究院 孟淑芳等报道的 KMB17 细胞的 16 个位点结果比对，16 个位点的 STR 分型图 谱完全相同，说明本研究中的检测样品就是 KMB17 细胞，DNA 提取与检测操 作过程以及检测结果具可行性和可靠性。Vero 细胞鉴别，根据美国国家标准与 技术研究院的 Almeida 等人研究报道参考选用了相应的 STR 位点：D8S1106、 D1S518、D6S1017、D17S1304、D4S2408、D5S1467、D19S245 和 DYS389 进 行。STR 分型得到的图谱和重复序列的重复数与 Almeida 等报道的研究结果完 全相同，表明我所疫苗生产用 Vero 细胞为正确细胞株，未被污染。进行检测的 操作过程具有可重复性，检测结果准确可靠。 外源因子污染是影响细胞基质安全性的一个重要的因素。在 2015 版《中国 药典》细胞内、外源病毒因子检查中，规定有猪源性病毒的检测。 聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction,PCR）是一种对特定的 DNA 片段在体外进行快速扩增的方法。具有特异性强，灵敏度高，操作简便、省时等 特点。本研究通过合成猪圆环病毒（porcinecircovirus ，PCV）及猪细环病毒 （Torquetenosusvirus，TTSuV）的基因组序列，转化入 pUC57 载体质粒中作为 阳性对照。以合成的阳性质粒为模版，对 PCR 的退火温度进行了优化，对方法 的特异性及灵敏度进行了验证，初步建立了我所疫苗生产用原材料胰蛋白酶、细 胞基质（包括生产用细胞 KMB17、Vero 和检定用细胞 KMB17、Vero、MRC-5、 Hep2、BT）及疫苗病毒收获液及成品的猪源性病毒 PCR 的检测方法。结果显示
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在检测的样品中没有检测到猪源性病毒的 DNA 片断；特异性验证：以克隆的 PCV1、PCV2、猪细小病毒（porcineparvovirus,PPV）、TTSuV1 和 TTSuV2 质 粒互为对照，所建立的 PCR 方法均只能扩增出特异目的片段，其他质粒均无 PCR 产物扩增。灵敏度验证：将 PCV、TTSuV 重组质粒稀释，使其浓度为 10ng/ul、 1ng/ul、100pg/ul、10pg/ul、1pg/ul、100fg/ul、10fg/ul、1fg/ul、0.1fg/ul，0.01fg/ul， 以其为模板进行 PCR 扩增，PCR 产物进行 2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示 PCV 的最低检测限为 0.1fg，即 1.34×104个拷贝的 PCV；TTSuV1 最低检测限为 10fg，即 1.92×106个拷贝数；TTSuV2 最低检测限为 0.01fg，即 1.94×103个拷 贝数。这些结果显示，初步建立的检测方法具有特异性和一定灵敏度，可以用于 我所疫苗生产的质量检定中。

Cellsubstrateisthemaincarrierofvaccineproductionandqualitycontrol includingprimarycells,diploidcellsandcontinuouscelllines.Nowtherearehuman diploidcellline(KMB17cell)andcontinuouscellline(Verocell)usedforvaccine productioninInstituteofMedicalBiology.Thesafetyofcellsubstratesisclosely relatedtothesafetyofthefinalproduct.Cellsubstratesshouldbetestedthoroughly includingcellidentificationandextraneousagentwhentheyareusedforthe productionandverification. Karyotypeanalysisisusedforcellidentificationinourinstitute.Thismethod canidentifyhumancells.HoweverhumandiploidcellsKMB17andMRC-5cannot beidentifiedbecauseofitssamechromosomecharacteristics.Shorttandemrepeat (STR)markersarehighlypolymorphicamonghumanpopulation.Andtheyhavebeen widelyusedinpaternitytest.Becauseofsimpleoperation,strongspecificity,high sensitivity,STR-PCRmethodisoneofthesimplestandmosteffectivemethodsfor cellidentificationandcrosscontamination. FortheshortcomingsoftheKaryotypeanalysisincellsubstrates,STRmethodis establishedforcellidentification.Thetechnologyofshorttandemrepeat(STR)-PCR methodwasusedtosequencenineteenautosomalloci19S433,D5S818,D21S11, D18S51,D6S1043,D3S1358,D13S317,D7S820,D16S539,CSF1PO,PentaD,vWA, D8S1179,TPOX,PentaE,TH01,D12S391,D2S1338,FGAandonesex chromosomelocusAMELinKMB17cellline.Theprofilesareidenticaldetermined bytwotimesofrepetitiveDNAprofiling.Comparedwithsixteenchromosomeloci reportedbyMengShufangfromNationalInstituteforFoodandDrugControl,the resultsofthesesixteenSTRprofilesareexactlythesame.Itprovesthatoursampleis KMB17cell.Thedetectionprocedureandresultsarefeasibleandreliable. AccordingtostudyofAlmeidafromNationalInstituteofStandardsand TechnologytheeightlociD8S1106,D1S518,D6S1017,D17S1304,D4S2408, D5S1467,D19S245andDYS389 respectivelyinVerocelllinewereusedto sequencebySTR-PCRmethod.TheprofileoftheVerocelllineandthenumberof repeatsareidenticalcomparedwiththeresearchresultsfromAlmeidaetal.Itproved thatVerocellforvaccineproductionisthecorrectcelllines,andisnotcontaminated. Testingoftheoperationprocessisrepeatable,accurateandreliable. Adventitiousvirusagentisanimportantfactorthataffectsthesecurityofcell substrate.Detectionofporcine-originvirusisaddedtopreparationofanimalcell
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substrateandqualitycontrolinthebiologicalproductsofproductionandquality control,sectionthree,2015editionof “Chinesepharmacopoeia”. PolymeraseChainReaction(PCR)isakindofmethodwithstrongspecificity, highsensitivity,simpleoperation,timesaving,etc.ItcanexpandspecificDNA fragmentsrapidlyinvitro.PCV(porcinecircovirus)andTTSuV(Torquetenosus virus)syntheticgenomesequenceswereinsertedintoPUC57carrierplasmidas positivecontrol.ThetemperaturesforannealinginPCRassaywereoptimized.The optimizedPCRassaywasverifiedforsensitivityandspecificity,andusedfortestsfor PCVandTTSuVinrawmaterial(forexample,trypsin),cellsubstrates(including KMB17,Vero,MRC-5,Hep2,BT),virusharvestsandfinalproductsofvaccine. Resultsshowed thattherewerenoporcineDNAfragmentsintestsamples.Specificity: PCV1andPCV2,Parvovirus(PPV),TTSuV1andTTSuV2plasmidsareusedas control,andspecificDNAbandswereamplifiedbythedevelopedPCRassayonly fromthegenomesofspecifictemplates,otherplasmids showedno PCRamplification. Sensitivity:PCVandTTSuVrecombinantplasmidswillbedilutedtothe concentrationof10ng/ul,1ng/ul,100pg/ul,10pg/ul,1pg/ul,100fg/ul,10fg/ul,1fg/ul, 0.1fg/ul,0.01fg/ul.WithitsasatemplateforPCRamplification,2%agarosegel electrophoresiswasusedtodetectPCRproduct.Theminimumdetectionlimitofthe developedPCRassayofPCVwas0.1fg,andisequalto1.34×104 copiesofPCV.The minimumdetectionlimitofthedevelopedPCRassayofTTSuV1andTTSuV2were 10fgand0.01fgrespectively.Andequalto1.92×106copiesofTTSuV1and 1.94×103 copiesofTTSuV2.TheseresultsshowthatthedevelopedPCRmethodhas thespecificityandsensitivity,andcanbeusedformyvaccineproductionandquality control.